Intradermal verabreichte mRNA

Jun 08, 2024

Nature Biomedical Engineering Band 7, Seiten 887–900 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Der Erfolg von Messenger-RNA-Therapeutika hängt weitgehend von der Verfügbarkeit von Abgabesystemen ab, die die sichere, wirksame und stabile Übersetzung von genetischem Material in funktionelle Proteine ​​ermöglichen. Hier zeigen wir, dass extrazelluläre Vesikel (EVs), die durch zelluläre Nanoporation aus menschlichen dermalen Fibroblasten hergestellt werden und mRNA einkapseln, die für extrazelluläres Matrix-α1-Typ-I-Kollagen (COL1A1) kodiert, die Bildung von Kollagen-Protein-Transplantaten induzierten und die Faltenbildung im Kollagen reduzierten. erschöpftes Hautgewebe von Mäusen mit lichtgealterter Haut. Wir zeigen auch, dass die intradermale Abgabe der mRNA-beladenen EVs über ein Mikronadel-Array zu einer längeren und gleichmäßigeren Synthese und einem gleichmäßigeren Ersatz von Kollagen in der Dermis der Tiere führte. Die intradermale Verabreichung von EV-basierter COL1A1-mRNA könnte eine wirksame Proteinersatztherapie zur Behandlung lichtgealterter Haut darstellen.

Jüngste Entwicklungen bei Boten-RNA-Modifikationstechniken haben die therapeutische Effizienz der mRNA-Abgabe und ihr Potenzial für kurzfristige klinische Anwendungen verbessert, einschließlich Proteinersatztherapie und Impfung gegen das Virus des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. 2. Die intrinsische Unfähigkeit und potenzielle Immunogenität von mRNAs erfordert jedoch, dass sie in Transportvehikeln eingekapselt werden. Aktuelle mRNA-Verabreichungsmodalitäten konzentrieren sich auf die Verwendung von Lipid-Nanopartikel-Trägern (LNP) zur Einkapselung und zum Transport3,4. LNPs stellen jedoch mehrere große Herausforderungen dar, darunter Zytotoxizität, schlechte Bioverteilung, mangelnde Zielspezifität und Immunogenität. Diese Probleme können durch die Notwendigkeit einer Oberflächen-PEGylierung (PEG steht für Poly(ethylenglykol)) von LNPs verursacht werden, um ihre Halbwertszeit im Blutkreislauf zu verbessern und die unspezifische Clearance zu reduzieren5,6. Insbesondere wurde die Verabreichung von LNPs bei Menschen mit Anaphylaxie, Überempfindlichkeit und unerwünschten Autoimmunereignissen in Verbindung gebracht7,8. Daher wäre die Identifizierung von mRNA-Trägern, die einige dieser LNP-assoziierten Herausforderungen bewältigen können, für die weitere Entwicklung mRNA-basierter Therapeutika hilfreich.

Extrazelluläre Vesikel (EVs), einschließlich Exosomen und Mikrovesikel, spielen eine wichtige Rolle beim Transport von Biomolekülen und Nukleinsäuren, einschließlich mRNAs, im menschlichen Körper9,10,11. Infolgedessen haben sich Elektrofahrzeuge in den letzten Jahren aufgrund ihrer intrinsischen Biokompatibilität, ihrer Fähigkeit, physiologische Barrieren zu überwinden und ihrer geringen Immunogenität als vielversprechende Träger für Nukleinsäure-basierte Therapeutika herausgestellt12,13. Im Gegensatz zu LNPs werden EVs, einschließlich Exosomen, endogen von den Körperzellen produziert und führen zu geringeren Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus wurden Strategien zur kostengünstigen und einfachen Herstellung großer Mengen an Exosomen entwickelt. Wir haben zuvor über eine Methode der zellulären Nanoporation (CNP) berichtet, bei der vorübergehende nanometrische Poren auf der Oberfläche von Quellzellen erzeugt wurden, um die groß angelegte Beladung vollständiger Transkript-mRNAs in sekretierte EVs zu ermöglichen14. Hier zeigen wir anhand eines Mausmodells der akuten Lichtalterung, das die pathophysiologischen Merkmale altersgeschädigter Haut beim Menschen genau nachahmt15, den Nutzen der Exosomen-basierten COL1A1-mRNA-Therapie als Ersatz für den dermalen Kollagen-Protein-Verlust als Anti-Aging-Behandlung bei Lichtalterung Haut. Um die Effizienz der mRNA-Abgabe und -Retention zu verbessern, zeigen wir auch, dass die Abgabe von Kollagen-mRNA über ein Hyaluronsäure (HA)-Mikronadelpflaster (COL1A1-EV MN) eine effizientere Verteilung der mRNA in der Dermis ermöglicht, was zu haltbarem Kollagen führt -Proteintransplantation und in einer verbesserten Behandlung von Falten bei lichtgealterter Haut.

Hautatrophie aufgrund eines irreversiblen Kollagenverlusts ist ein Kennzeichen der Hautalterung16,17. Zahlreiche Methoden zielen darauf ab, den Verlust von Kollagenprotein in der Haut wiederherzustellen, und reichen von rezeptfreien und pharmazeutischen Ansätzen (Antioxidantien18,19,20, Retinoide21, Peptide22,23) bis hin zu medizinischen Geräten (d. h. Lasertherapie24 und synthetische Hautfüller25,26). . Allerdings war keine dieser bestehenden Technologien in der Lage, einen langfristigen endogenen Kollagenersatz zu erreichen, um die Festigkeit, Festigkeit und Elastizität der Haut über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten27,28,29. Die Stimulierung von Fibroblasten, die für die Synthese von Kollagenproteinen verantwortlich sind, kann auch ein wirksames Mittel zur kurzfristigen Kontrolle der Hautalterung sein30. Allerdings verlieren Fibroblasten mit zunehmendem Alter allmählich ihre Fähigkeit, sich zu vermehren und Kollagen zu synthetisieren, was zu Herausforderungen für längerfristige Methoden des Kollagenersatzes für Anti-Aging-Behandlungen führt31. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wollten wir Kollagenprotein in einem Photoaging-Kollagendepletionsmodell durch EV-vermittelte mRNA-Abgabe ersetzen. Um mit menschlicher Kollagen-I-Alpha-I-mRNA (COL1A1) beladene Elektrofahrzeuge zu erzeugen, verwendeten wir eine CNP-Technik, bei der eine Monoschicht neonataler menschlicher dermaler Fibroblasten (nHDFs) auf einer Nanoporenoberfläche plattiert und die Zellen mit einem COL1A1-GFP-Plasmid nanotransfiziert wurden ( Abb. 1a und ergänzende Abb. 1a)14. EVs wurden am Tag nach der Transfektion aus Kulturmedien isoliert. Es wurde festgestellt, dass mit CNP behandelte Zellen eine zehnfach höhere EV-Zahl pro Zelle aufwiesen als Zellen, die mit Standard-Massenelektroporation (BEP) behandelt wurden, die wie zuvor beschrieben unter Verwendung paralleler Küvettenelektroden durchgeführt wurde32, oder unbehandelte nHDFs in Kultur (Abb . 1b). Die mit jeder Methode erzeugten Elektrofahrzeuge waren durch eine Größenverteilung mit einem Spitzenwert von etwa 150 nm im Durchmesser gekennzeichnet, wie durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestimmt, und 80 % der Intensität im Modenspitzenwert durch dynamische Lichtstreuung (DLS) (Abb. 1c und Ergänzung). Abb. 1b,c) mit einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,12–0,25. Western-Blot-Experimente zeigten, dass die Expression von Exosomen- (CD9, CD63, TSG101) und Mikrovesikel-Biomarkern (ARF6) in der mit CNP behandelten Gruppe signifikant höher war als in der unbehandelten Gruppe, was den Anstieg der sekretierten EVs bestätigte (ergänzende Abbildung 1d). Kinetische Analysen zeigten außerdem, dass die spannungsoptimierte EV-Freisetzung 8 Stunden nach der CNP-Induktion ihren Höhepunkt erreichte, wobei über die nächsten 24 Stunden eine fortgesetzte Sekretion festgestellt wurde (ergänzende Abbildung 1e, f). Die quantitative Polymerasekettenreaktion mit umgekehrter Transkription (RT-qPCR) zeigte, dass CNP-sekretierte EVs mehr als das 200-fache der COL1A1-mRNA enthielten als BEP-sekretierte EVs und eine 3.000-fach höhere COL1A1-mRNA als EVs, die aus nicht transfizierten Zellen sezerniert wurden (Abb. 1d). ). Die bioanalytische Beurteilung von Gelagarose zeigte, dass COL1A1-mRNA in voller Länge bei etwa 4.000 Nukleotiden transkribiert wurde (Abb. 1e). Durch CNP hergestellte EVs zeigten strukturelle Stabilität, wenn sie für die präklinische Verabreichung bei 4 °C gelagert wurden, ohne Veränderungen im Aussehen, in den Membran- und Größeneigenschaften bei der Auswertung mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und NTA (ergänzende Abbildung). . 2a–c). Darüber hinaus war die in EVs eingekapselte COL1A1-mRNA sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4 ° C stabil und zeigte auch Serumstabilität, was ihr Potenzial für einen zukünftigen klinischen Nutzen unterstreicht (ergänzende Abbildung 2d, e).

a, Schematische Darstellung von CNP-generierten EVs für die gezielte Nukleinsäureabgabe. b, EV-Anzahl pro Zelle, produziert von unbehandelten nHDFs in PBS-Puffer als Kontrolle, BEP oder CNP mit PBS-Puffer nur in 24 Stunden (n = 3 für jede Gruppe; *P = 0,048 Kontrolle vs. BEP; **P = 0,005 Kontrolle vs. CNP ; ##P = 0,002 BEP vs. CNP). c, Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch Nanopartikel-Tracking-Analyse. d, RT-qPCR von COL1A1-mRNA zeigt, dass von CNP produzierte EVs viel größere Mengen transkribierter mRNAs enthalten als EVs, die von BEP- und Kontrollgruppen in 24 Stunden produziert wurden (n = 3 für alle Gruppen; **P = 0,002 Kontrolle vs. BEP; * **P < 0,001 Kontrolle vs. CNP; ###P < 0,001 BEP vs. CNP). e, Gelelektrophorese der Gesamt-RNA, die aus 3,78 × 108 EVs extrahiert wurde, die aus CNP unter Verwendung des COL1A1-GFP-Plasmids hergestellt wurden, im Vergleich mit synthetischer in vitro transkribierter COL1A1-mRNA als Kontrolle. f, Proliferation von nHDFs nach Behandlung mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen von COL1A1-EVs nach 0 h, 24 h und 48 h (n = 4 für alle Gruppen; nach 24 h: #P = 0,0107, 10 µg ml−1 vs. 0 µg ml −1 der Proteinkonzentration von COL1A1-EVs nach der Behandlung; ##P = 0,002, 20 µg ml−1 vs. 0 µg ml−1; ###P < 0,001, 30 µg ml−1 vs. 0 µg ml−1; bei 48 h: *P = 0,045, 10 µg ml-1 vs. 0 µg ml-1 der COL1A1-EV-Behandlung; ***P < 0,001, 20 µg ml-1 vs. 0 µg ml-1; ***P < 0,001 , 30 µg ml−1 vs. 0 µg ml−1). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die Vergleiche in b und d wurden zweiseitige Student-t-Tests verwendet. Für die Vergleiche in f wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. Der Schaltplan in a wurde mit BioRender.com erstellt.

Um das therapeutische Potenzial von COL1A1-mRNA-haltigen EVs (COL1A1-EVs) in vitro zu beurteilen, behandelten wir kultivierte Fibroblasten 48 Stunden lang mit COL1A1-EVs (ergänzende Abbildung 3a). Es wurde beobachtet, dass die Proliferation von Fibroblasten mit der Behandlung mit COL1A1-EV dosisabhängig zunahm (Abb. 1f). Nach der Behandlung wurde in mit COL1A1-EVs behandelten Fibroblasten eine erhöhte COL1A1-Proteinexpression beobachtet, was durch eine erhöhte Co-Lokalisierung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) mit COL1A1 unter Immunfluoreszenzmikroskopie belegt wurde. Im Gegensatz dazu waren die COL1A1-Spiegel ohne Co-Lokalisierung von GFP in der nicht behandelten Gruppe wesentlich niedriger (Extended Data Abb. 1a,b). Die erfolgreiche mRNA-Abgabe in Empfängerzellen wurde außerdem durch eine erhöhte Kollagen-mRNA-Expression und Kollagenproteinspiegel bestätigt, die mittels quantitativer PCR bzw. Western-Blot-Analyse in mit COL1A1-EVs behandelten Fibroblasten gemessen wurden (Erweiterte Daten, Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 3b). . Darüber hinaus war Prokollagen I, ein Vorläufer des COL1-Proteins, nach der Behandlung mit COL1A1-EV signifikant erhöht, was auf eine verbesserte COL1-Proteinsynthese durch die mit EV behandelten Fibroblasten im Vergleich zu unbehandelten Fibroblasten hinweist (Extended Data, Abb. 1e). Die konfokale Mikroskopie der zellulären Aufnahme von Elektrofahrzeugen zeigte, dass die Abgabe von Elektrofahrzeugen an Empfängerzellen durch Clathrin-vermittelte Endozytose vermittelt wird (ergänzende Abbildung 3c, d) und zum Entweichen von Lysosomen fähig ist (ergänzende Abbildung 4). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass funktionelle COL1A1-mRNA durch CNP stabil in EVs eingekapselt werden kann und dass dieses COL1A1-EV-Abgabesystem die COL1A1-Proteinexpression in vitro erheblich steigern kann.

Um die Kinetik der EV-vermittelten COL1A1-mRNA-Abgabe und Proteinbildung in vivo zu verstehen, haben wir eine Kopienzahl von 2,7 × 109 COL1A1-mRNA-COL1A1-EVs über eine Insulinnadelspritze in die Dermis von Mäusen verabreicht. Die Mäuse wurden in den nächsten 14 Tagen zur histologischen Analyse mit RNAscope zur COL1A1-mRNA-Quantifizierung getötet. Es wurde festgestellt, dass COL1A1-mRNA 12 Stunden nach der Entbindung im lokalen Hautgewebe signifikant erhöht war, wobei 24 und 48 Stunden nach der Injektion ein deutlicher Rückgang beobachtet wurde und nach 96 Stunden eine Rückkehr zu den COL1A1-mRNA-Ausgangswerten erfolgte (Abb. 2a, b). Die In-vivo-Translation von COL1A1-mRNA in Protein wurde durch Immunfluoreszenzmikroskopie von explantiertem Gewebe über einen Zeitraum von 30 Tagen bewertet. Mit GFP+ COL1A1+ immungefärbte Transplantate wurden bereits 12 Stunden nach der Injektion beobachtet, wobei die maximale Fluoreszenz 4 Tage nach der Entbindung auftrat (Abb. 2c – e). Es wurde beobachtet, dass GFP+ COL1A1+-Proteintransplantate vom 4. bis zum 30. Tag nach der Injektion zeitabhängig abnahmen, wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde, wobei sich der Großteil des COL1A1-EV-abgeleiteten Proteins am 30. Tag umsetzte. Diese Ergebnisse zeigen, dass niedrigere Dosen erforderlich sind Die Verabreichung von COL1A1-EV führt zu einem 3–4-tägigen Peak des COL1A1-Proteins im Empfängergewebe, der am 30. Tag nach der Injektion auf den Ausgangswert absinkt.

a: In-situ-Hybridisierung menschlicher COL1A1-mRNA durch RNAscope nach intradermaler Injektion von COL1A1-EVs und Kochsalzlösungskontrolle, gemessen 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 96 Stunden, 7 Tage, 10 Tage und 14 Tage nach der Injektion. Maßstabsleiste, 100 µm. b, Quantifizierung der RNAscope-Ergebnisse anhand der durchschnittlichen Anzahl brauner Punkte pro Zelle. c: Immunfluoreszenz des von COL1A1-EV abgeleiteten Proteins über die Zeit durch Visualisierung von co-lokalisiertem GFP und COL1A1-Protein (RFP). Maßstabsbalken, 100 µm. d, Fluoreszenzintensitätsquantifizierung der COL1A1-GFP-Proteinexpression. e: Die Quantifizierung von GFP+-Zellen bestätigt, dass die COL1A1-EV-abgeleiteten Proteintransplantate über 30 Tage zeitabhängig abnehmen. Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Dermale Lichtalterung ist durch die Zerstörung von Kollagen und Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) in der Haut durch Sonneneinstrahlung und UV-Strahlung gekennzeichnet, was zur Bildung von Falten führt33,34. Um die Fähigkeit von COL1A1-mRNA-EVs zu beurteilen, abgebautes Kollagenprotein in vivo zu ersetzen, verwendeten wir ein zuvor beschriebenes Photoalterungsmodell, bei dem athymische Nacktmäuse über einen Zeitraum von 8 Wochen mit UV-Bestrahlung (311 nm) behandelt wurden, was zu Hautfalten als Folge von Kollagen führte Erschöpfung35 (Ergänzende Abbildung 5a). Die Wirksamkeit des 8-wöchigen UV-Bestrahlungsverlaufs beim Abbau von Kollagen- und Elastinfasern in der Haut von Mäusen wurde durch histologische Analyse und Gewebeanalyse bestätigt (ergänzende Abbildung 5b – g). Als nächstes untersuchten wir das therapeutische Potenzial von COL1A1-EVs, Hautkollagen in UV-bestrahlten Mäusen zu ersetzen, indem wir die Tiere mit einem 5-fachen Injektionszyklus behandelten: (1) 2,7 × 109 Kopienzahl der in EVs eingekapselten COL1A1-mRNA (COL1A1-EVs) , (2) 2,7 × 109 Kopienzahl von COL1A1-mRNA, eingekapselt in Lipid-Nanopartikeln (COL1A1-LNPs), (3) Kontroll-EVs ohne CNP-Frachtbeladung (unbeladene EVs), (4) 0,05 %ige topische Retinsäure-Behandlung (RA) oder ( 5) Kochsalzlösungskontrolle. Die Faltenbildung wurde an den Tagen 0, 4, 7, 14, 21 und 28 nach Beginn der Behandlung verfolgt, und alle Tiere wurden am 28. Tag für Histologie- und Hautpflaster-Replika-Analysen getötet36 (Abb. 3a). Mikroskopische Aufnahmen dermaler Hautfalten über den Behandlungszeitraum zeigten bei den COL1A1-LNPs, unbelasteten EVs und Retinsäuregruppen im Vergleich zur Kochsalzlösungs-Kontrollgruppe eine leichte Abnahme der Faltenanzahl und -fläche bis zum 28. Tag (Abb. 3b). Im Gegensatz dazu zeigten mit COL1A1-EVs behandelte lichtgealterte Mäuse ab Tag 7 nach Beginn der Behandlung eine Verringerung der Faltenanzahl und -fläche, mit einer signifikanten Verringerung ab Tag 14 auf ähnliche Werte wie bei unbestrahlten Scheinkontrollen (Abb. 3c, d). ). Hautpflasternachbildungen der Rückenhaut, die am Tag 28 nach Behandlungsbeginn angefertigt wurden, bestätigten die Wirksamkeit von COL1A1-EVs zur Behandlung lichtgealterter Haut im Vergleich zu Kochsalzlösungskontrolle, Retinsäure, unbelasteten EV-Kontrollen und COL1A1-LNPs (Erweiterte Daten, Abb. 2). Bemerkenswerterweise zeigten COL1A1-LNPs auch eine Verringerung der Faltenanzahl und -fläche im Vergleich zur Kontrolle mit Kochsalzlösung, Retinsäure und unbelasteten EV-Kontrollen, obwohl dieser Effekt nicht so ausgeprägt war wie bei COL1A1-EVs. Mit COL1A1-EVs und COL1A1-LNPs behandelte Haut zeigte auch eine höhere Elastizität und Festigkeit, gemessen mit einem Cutometer bzw. einem Instron-Extensometer (ergänzende Abbildung 6).

a, Schematische Darstellung und Zeitleiste von 5 niedrig dosierten Injektionen von COL1A1-EVs (2,7 × 109 Kopienzahl COL1A1-mRNA pro Dosis). Nach 28 Tagen wurde Hautgewebe gesammelt. b: Die Faltenbildung wurde an den Tagen 0, 4, 7, 14, 21 und 28 nach der ersten Verabreichung von COL1A1-EVs, COL1A1-LNPs, unbeladenen EVs, 0,05 % Retinsäure (RA) oder Kochsalzlösung verfolgt (n = 4 für alle Gruppen). ). Die Scheingruppe bestand aus weiblichen Nacktmäusen, die keiner UV-Strahlung ausgesetzt waren. Maßstabsleiste, 5 mm. c, Gesamtzahl der mit individueller Software quantifizierten Rückenhautfalten (n = 4 für alle Gruppen; ※※P = 0,0016 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 7; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 14, 21 und 28; **P = 0,0089 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 21; **P = 0,0097 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 28; #P = 0,461 Unbeladene EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ##P = 0,0034 Unbeladen EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 28; †P = 0,0142 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ††P = 0,0069 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 28). d, Quantifizierung des Faltenbereichs auf der Rückenhaut (n = 4 für alle Gruppen; ※※P = 0,0063 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 7; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung an den Tagen 14, 21 und 28; **P = 0,0082 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 28; ††P = 0,0040 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 28; ##P = 0,0018 Unbeladene EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 28). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die Vergleiche in c und d wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet. Der Schaltplan in a wurde mit BioRender.com erstellt.

Um die immunogenen Nebenwirkungen von COL1A1-LNPs und COL1A1-EVs zu beurteilen, wurde einer Untergruppe von Tieren behandelte Haut entnommen und 24 Stunden nach der Injektion auf Entzündungen analysiert. Mit COL1A1-LNPs behandelte Haut zeigte Rötungen und Schwellungen im Vergleich zu Scheinkontrollen und mit COL1A1-EVs behandelter Haut (Extended Data Abb. 3a). Durchflusszytometrie und enzymgebundener Immunoassay (ELISA) von Gewebe zeigten außerdem ein massives Leukozyteninfiltrat, das von Neutrophilen dominiert wird, in Gewebe, das COL1A1-LNPs erhielt (Extended Data Abb. 3b, c) und hohe Mengen an entzündlichen Zytokinen wie TNF-α, IL- 6, IL-1β und IFN-γ (Extended Data Abb. 3d – f). Im Vergleich dazu zeigte Gewebe, das mit COL1A1-EV behandelt wurde, keine starke Entzündungsreaktion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass LNPs wesentlich immunogener sind als EVs.

Nach der Beurteilung am 28. Tag wurde eine Untergruppe der Tiere weitere 4 Wochen lang behalten, um die Dauer der Faltenreduzierung zu überwachen. Hautfalten traten bereits eine Woche später wieder auf, beginnend am 35. Tag nach Behandlungsbeginn, und am 56. Tag waren die Hautfalten statistisch nicht mehr von den Werten vor der Behandlung zu unterscheiden (Extended Data, Abb. 4).

Um die dermale Kollagentransplantation durch die Abgabe von COL1A1-EV zu bewerten, wurde am Tag 28 nach Beginn der Behandlung aus allen Gruppen Haut herausgeschnitten und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sowie Masson-Trichrom-Färbung beurteilt. Die histologische Analyse und die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität ergaben, dass die COL1A1-Proteinexpression nach der COL1A1-EV-Behandlung im Vergleich zu anderen Gruppen signifikant wiederhergestellt wurde (Abb. 4a, b). Die Masson-Trichrom-Färbung bestätigte ein höheres Maß an Kollagenfärbung und Hautdicke (197,95 ± 24,46 μm COL1A1-EVs vs. 95,19 ± 10,66 μm Kochsalzlösung am Tag 28, P < 0,001) bei Mäusen, denen COL1A1-EVs verabreicht wurden, als bei Mäusen, denen Kochsalzlösungskontrolle, Retinsäure, entladene Elektrofahrzeuge oder COL1A1-LNPs (Abb. 4c, d).

a, Immunfluoreszenzfärbung für GFP und COL1A1 (RFP)-Protein in der Scheinkontrollgruppe, der Kochsalzkontrollgruppe, der RA-Behandlungsgruppe, der unbelasteten EV-Behandlungsgruppe, den COL1A1-LNPs und COL1A1-EV-Behandlungsgruppen. COL1A1-EV-behandelte Mäuse zeigten 28 Tage nach Beginn der Behandlung GFP+ COL1A1-Proteintransplantate in der Dermis und Subkutis. Maßstabsbalken, 200 µm. b, Fluoreszenzintensität des COL1A1-Proteins (RFP) für alle Behandlungsgruppen (n = 3 für alle Gruppen; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung; #P = 0,0386 Unbeladene EVs vs. Kochsalzlösung; †P = 0,0218 RA vs. Kochsalzlösung; +P = 0,0255 COL1A1-EVs vs. COL1A1-LNPs). c: Repräsentative Masson-Trichrom-Kollagen-Färbung der Epidermis, Dermis und Subkutis für alle Mausgruppen. Kollagen ist blau. Maßstabsbalken, 200 µm. d, Quantifizierung der Hautdicke, die erhöhte Kollagenfasern in der COL1A1-EVs-Gruppe zeigt (n = 3 für alle Gruppen; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung; #P = 0,0437 unbeladene EVs vs. Kochsalzlösung; †P = 0,0447 RA vs. Kochsalzlösung; +++P < 0,001 COL1A1-EVs vs. COL1A1-LNPs). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die Vergleiche in b und d wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet.

Da festgestellt wurde, dass Falten bei lichtgealterten Tieren innerhalb eines Monats nach Beendigung der COLA1-EV-Behandlung wieder auf das Ausgangsniveau zurückkehren, wollten wir als nächstes die Dauer des Proteinersatzes und die Wirksamkeit der Kollagentransplantation durch die Entwicklung einer HA-Mikronadelformulierung (COL1A1-EV MN) verbessern. um die EV-vermittelte mRNA-Gewebeabgabe zu verbessern. Kundenspezifische Mikronadelpflaster wurden mithilfe eines Mikroformverfahrens hergestellt, bei dem COL1A1-EVs mit einer 15 %igen HA-Lösung, gelöst in PBS, gemischt und in die Spitzen einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Form gegossen wurden, indem 30 Minuten lang ein Vakuum aufrechterhalten wurde. Anschließend wurde 1 ml hinzugefügt Eine 15 Gew.-%ige HA-Lösung wurde in die Mikroform gegeben und dann zur Verfestigung 4 Stunden lang auf 4 °C überführt (Abb. 5a). Jede Nadel des COL1A1-EV-Mikronadelpflasters wurde in einer konischen Form geformt, mit einem kreisförmigen Durchmesser von 400 µm an ihrer Basis und einer Höhe von 1.000 µm (Abb. 5b). Die mechanische Festigkeit von mit Elektrofahrzeugen beladenen Pflastern mit 10 %, 15 % oder 20 % HA wurde mit einer Zugprüfmaschine bewertet (ergänzende Abbildung 7a). Es wurde bestätigt, dass die Lastbruchkraft unseres 15 % COL1A1-EV MN höher ist als die minimale durchschnittliche Kraft, die für die Hautpenetration erforderlich ist (0,058 N)37 (ergänzende Abbildung 7b). Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) bestätigte, dass die Mikronadeln durch das Stratum corneum in die Dermis eindrangen (516 ± 76 μm)38 (Abb. 5c). Es wurde festgestellt, dass in HA-Mikronadeln geladene COL1A1-EVs ein stabiles Aussehen und eine stabile Membranintegrität aufweisen, wie durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und AFM bewertet wurde, sowie eine stabile COL1A1-mRNA- und Partikelgrößenverteilung (ergänzende Abbildung 7c – f). Zur Abgabe in das Gewebe wurden COL1A1-EV-MN-Pflaster in die Rückenhaut von Mäusen gedrückt und die Mikronadelbasis nach 15 Minuten entfernt (Ergänzungsvideo 1). Während dieser Zeit lösten sich die Mikronadeln vollständig auf, ohne sichtbare Hautreizungen oder Markierungen an der Verabreichungsstelle (Abb. 5d und Zusatzvideo 2). Um die Gewebeverteilung von über Mikronadeln abgegebenen Elektrofahrzeugen mit der von über eine Insulinspritze abgegebenen Elektrofahrzeugen zu vergleichen, wurden Elektrofahrzeuge mit DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat; Beyotime, C1036) markiert39 und intradermal unter der Rückenhaut von Empfängermäusen verabreicht, mit anschließender histologischer Beurteilung durch Immunfluoreszenzmikroskopie (Abb. 5e und ergänzende Abb. 8a, b). Die Analyse der Gewebeverteilung ergab, dass die Injektion mit einer Spritzennadel zu einer ungleichmäßigen Abgabe von Elektrofahrzeugen mit Verklumpung in bestimmten Bereichen der Dermis und Subkutis führte, wohingegen mittels Mikronadel abgegebene Elektrofahrzeuge besser in der Dermis und Subkutis verteilt waren (Abb. 5f und ergänzende Abb. 8c, d). . Die Beurteilung der EV-Membranintegrität durch Kryo-EM zeigte eine geringere EV-Membranlyse bei den EVs, die mit dem Mikronadelpflaster verabreicht wurden, im Vergleich zur Spritzennadel (18,1 ± 3,0 % COL1A1-EV MN vs. 28,3 ± 2,4 % Nadelinjektion, P = 0,022) (Ergänzende Abb . 8e,f). Um zu beurteilen, ob die verbesserte Gewebeverteilung und der EV-Membranschutz zu einer verbesserten EV-Transplantation führten, verwendeten wir als nächstes eine serielle In-vivo-Fluoreszenzbildgebung von DiI-markierten EVs, die Mäusen über einen Zeitraum von 14 Tagen intradermal injiziert wurden. Die Fluoreszenzbildgebung bestätigte für die ersten 4 Tage nach der Injektion ein ähnliches DiI-EV-Signal zwischen mit einer Spritze verabreichten Elektrofahrzeugen und mit Mikronadeln verabreichten Elektrofahrzeugen. Allerdings wies die COL1A1-EV-Mikronadelgruppe am Tag 4 (69,61 ± 6,4 % COL1A1-EV MN vs. 45,79 ± 2,5 % Nadelinjektion, P < 0,001) und am Tag 7 (35,78 ± 5,9 % COL1A1-EV MN) ein signifikant höheres Fluoreszenzsignal auf vs. 19,38 ± 3,8 % Nadelinjektion, P < 0,001), anhaltend bis zum 10. Tag nach der Injektion (30,22 ± 2,6 % COL1A1-EV MN vs. 6,68 ± 1,3 % Nadelinjektion, P < 0,001) (Abb. 5g, h). Ex-vivo-Organverteilungsanalysen der Fluoreszenz der DiI-Sonde über einen Zeitraum von zwei Wochen zeigten eine ähnliche Gewebeverteilung und einen ähnlichen Signalabfall bei Tieren, die eine intradermale Injektion erhielten, und bei Tieren, die eine Mikronadel-Verabreichung erhielten, was darauf hindeutet, dass die Verringerung der Signalintensität auf den Metabolismus der DiI-Sonde zurückzuführen ist, wie gezeigt in anderen ähnlichen Studien 40, 41 (Ergänzende Abbildung 9a, b). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Verwendung des Mikronadelpflasters die langfristige Retention von EVs im Gewebe verbessert.

a, Schematische Darstellung der Mikronadelherstellung. b, Mikroskop- und Rasterelektronenmikroskopbilder von Mikronadel-Arrays. Maßstabsbalken, 500 µm. c, H&E-gefärbter Abschnitt der Maushaut zeigt das Eindringen einer einzelnen Mikronadel. Maßstabsbalken, 100 µm. d, Oben: Zeitverlauf der in die Haut gedrückten HA EV-Mikronadelspitzen; Die Mikronadeln lösten sich innerhalb von 15 Minuten nach der Anwendung auf. Maßstabsbalken, 200 µm. Unten: Die Hauterholung nach der HA EV-Mikronadelbehandlung zeigt minimale Reizungen. Maßstabsbalken, 5 mm. e: Die Hauthistologie von Dil-markierten EVs zeigt hochkonzentrierte EVs (rot), die nach der Spritzennadelinjektion ungleichmäßig in der Unterhaut verteilt waren, wohingegen mit Mikronadeln abgegebene EVs gleichmäßiger im Gewebe verteilt waren. Gelbe gestrichelte Linien umkreisen repräsentative subkutane Haarzwiebeln und begrenzen repräsentative stäbchenförmige Teile des Follikels, die sich nach oben bis zur Dermis erstrecken. Maßstabsbalken, 100 µm. f, Repräsentative EV-Verteilung, analysiert mit der ImageJ-Software. g, In-vivo-Fluoreszenzbilder von Nacktmäusen, die an den Tagen 1, 2, 4, 7, 10 und 14 nach der Entbindung mit intradermaler Injektion oder HA-Mikronadelpflaster-Verabreichung von Dil-markierten EVs behandelt wurden (n = 3 für alle Gruppen). h, Quantifizierung der Fluoreszenzintensität über den 14-tägigen Behandlungszeitraum. Die Daten werden auf die Fluoreszenzintensität am Tag 1 normiert. Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. ***P < 0,001 COL1A1-EV MN-Verabreichungsgruppe vs. Nadel-Verabreichungsgruppe. Für die Vergleiche in h wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet. Der Schaltplan in a wurde mit BioRender.com erstellt.

Als nächstes testeten wir, ob die Verwendung unseres maßgeschneiderten COL1A1-EV-Mikronadelpflasters zur Abgabe von COL1A1-EVs zu einem verbesserten In-vivo-Proteinersatz in der Haut von lichtgealterten Mäusen führen könnte (ergänzende Abbildung 10). Athymische Mäuse wurden erneut 8 Wochen lang UV-Bestrahlung ausgesetzt und einer von 5 Behandlungsgruppen zugeordnet: (1) Kochsalzlösungskontrolle, (2) COL1A1-mRNA-EVs, die mit einer Spritzennadel abgegeben wurden, (3) HA-Mikronadelkontrolle, (4) unbeladene Elektrofahrzeuge, die mit einer Spritzennadel abgegeben wurden HA-Mikronadel (unbeladene EV-Mikronadel) und (5) COL1A1-mRNA-beladene EVs, geliefert von HA-Mikronadel (COL1A1-EV MN). Allen Mäusen wurde am Tag 0 des Behandlungszeitplans eine Einzeldosis-Injektion von 22 × 109 Kopien der COL1A1-mRNA (oder einem äquivalenten Vehikelvolumen für Kontrollgruppen) verabreicht. Nach der Injektion wurden alle Mäuse bis zu 3 Monate lang mittels mikroskopischer Fotografie der Hautfalten auf dem Rücken überwacht (Abb. 6a). Im Vergleich zur Spritzennadelinjektion, die die Faltenbildung bis zu 35 Tage vor einer Rückkehr zum Ausgangswert vor der Behandlung reduzierte, wurde festgestellt, dass die Verabreichung von COL1A1-mRNA durch COL1A1-EV MN die Faltenfläche und -anzahl bis zu 70 Tage vor einer Rückkehr erheblich reduzierte auf die Ausgangswerte (Abb. 6b, c). Um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen, wurde eine Untergruppe von Mäusen aus jeder Gruppe 1 Monat, 2 Monate und 3 Monate nach der Behandlung getötet, um die Rückenhaut und die Histologie mit einem Hautreplikatpflaster zu beurteilen (Erweiterte Daten, Abb. 5a – c). Sowohl die Nadelinjektions- als auch die COL1A1-EV-MN-Behandlung reduzierten die Länge und Tiefe der Falten bis zu einem Monat nach der Behandlung (Erweiterte Daten, Abb. 5d, e). Allerdings zeigten nur Mäuse, die mit COL1A1-EV MN behandelt wurden, bis zum 2-Monats-Zeitpunkt eine signifikante, langanhaltende Verringerung der Faltenlänge und -tiefe. Um zu testen, ob der Kollagenersatz und die Faltenbehandlung über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden können, haben wir weitere Tierkohorten einer seriellen Behandlung mit COL1A1-EVs unterzogen, die alle 30 Tage mit einer Spritzennadel und einer Mikronadel verabreicht wurden. Es wurde festgestellt, dass sowohl COL1A1-EVs, die mit einer Spritzennadel verabreicht wurden, als auch COL1A1-EV MN die Anzahl und Fläche der Falten reduzierten, solange die Tiere behandelt wurden, wobei COL1A1-EV MN-Tiere die stärkste Verbesserung zeigten (Extended Data Abb. 6).

a, Langzeitbeobachtung (91 Tage) von 4 Behandlungsgruppen nach einer einzigen Injektion: (1) Kochsalzlösungskontrolle, (2) COL1A1-EVs (22 × 109 Kopienzahl COL1A1-mRNA), abgegeben mit einer 28G-Spritzennadel, (3) HA Mikronadel-Kontrolle, (4) unbeladene EVs, geliefert durch HA-Mikronadel (unbeladene EV-Mikronadel) und (5) COL1A1-EV MN (22 × 109 Kopienzahl COL1A1 mRNA), (n = 4 für alle Gruppen). Maßstabsbalken, 5 mm b, Quantifizierung der Gesamtzahl der Falten (n = 4 für alle Gruppen; *P = 0,014 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 7; *P = 0,038 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 14; * P = 0,012 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 21; *P = 0,039 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 28; *P = 0,031 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 35; *P = 0,03 COL1A1-EV MN vs Kochsalzlösung am Tag 42; *P = 0,022 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 49; *P = 0,031 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 56; **P = 0,008 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 63; #P = 0,030 Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung am Tag 7; #P = 0,041 Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung am Tag 14; †P = 0,047 HA-Mikronadel vs. Kochsalzlösung am Tag 14). c, Quantifizierung der gesamten dorsalen Hautfaltenfläche (n = 4 für alle Gruppen; *P = 0,016 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 7; *P = 0,038 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 14; *P = 0,042 COL1A1 -EV MN vs. Kochsalzlösung an den Tagen 21 und 28; *P = 0,026 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 42; *P = 0,048 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 49; #P = 0,033 Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung am Tag 7 ; #P = 0,031 Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung am Tag 14; #P = 0,042 Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung am Tag 21). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die Vergleiche in b und c wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet.

Die histologische Analyse der nach der Behandlung entnommenen Hautproben bestätigte die dauerhafte Transplantation des GFP+ COL1A1-Proteins in der Dermis und Subkutis von Mäusen sowohl in der Nadelinjektionsgruppe als auch in der COL1A1-EV-Mikronadelgruppe einen Monat nach der Entbindung (Abb. 7a). Nach zwei Monaten zeigten jedoch nur die Mäuse in der COL1A1-EV-Mikronadelkohorte eine GFP+ COL1A1-Transplantation in der Dermis und Subkutis (Abb. 7b). Drei Monate nach der Entbindung wiesen die Hautproben aller Gruppen keine GFP-Kollagentransplantation auf (Abb. 7c). Die COL1A1+ GFP-Immunfluoreszenzintensität wurde quantifiziert, was die Ergebnisse der Faltenmikroskopie stützte, die eine wirksame Behandlung an den Tagen 30–60 und eine Rückkehr zum Ausgangswert vor der Behandlung an den Tagen 70–90 zeigten (Abb. 7d). Die immunhistochemische Färbung des COL1A1-Proteins und die Masson-Trichrom-Färbung des Hautgewebes bestätigten, dass die Kollagenmenge in der Dermis mit den Ergebnissen der Immunfluoreszenzmikroskopie korrelierte und dass die COL1A1-EV-MN-Gruppe unter allen Kohorten die häufigsten Kollagenfasern und die höchste Hautdicke aufwies (180,14). ± 21,46 μm COL1A1-EV MN vs. 96,61 ± 14,00 μm Kochsalzlösung nach 1 Monat, P < 0,001; 154,88 ± 8,27 μm COL1A1-EV MN vs. 109,25 ± 10,86 μm Kochsalzlösung nach 2 Monaten, P < 0,05) (Abb. 7e,f) . Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Einkapselung und Abgabe von COL1A1-mRNA über unser COL1A1-EV-MN-System den Kollagenproteinersatz in lichtgealterter Haut um mehr als das Doppelte der Dauer der Spritzennadelabgabe verlängern kann.

a–c Immunfluoreszenzfärbung von GFP und COL1A1 (RFP) zeigt GFP-positive COL1A1-Proteintransplantate in der Haut von Mäusen, die bis zu 1 Monat (28 Tage) nach der Entbindung COL1A1-EVs über eine 28G-Nadelinjektion und über COL1A1-EV MN erhalten. Nach 2 Monaten (63 Tagen) hatten nur Mäuse, die mit COL1A1-EV MN behandelt wurden, eine langfristige GFP-positive COL1A1-Transplantation. Bis 3 Monate (91 Tage) nach der Entbindung konnte bei keiner Maus ein Hinweis auf GFP-positives Kollagenprotein nachgewiesen werden. Maßstabsbalken, 200 µm. d, Quantifizierung des kolokalisierten Fluoreszenzsignals von GFP und COL1A1 (RFP) zeigt eine langfristige COL1A1-EV-abgeleitete Kollagentransplantation in der Haut von Mäusen, denen COL1A1-EV MN verabreicht wurde, im Vergleich zu Mäusen, denen COL1A1-EVs über eine 28G-Nadelinjektion verabreicht wurden, und Kontrollgruppen ( n = 3 für alle Gruppen; ***P < 0,001 COL1A1-EV MN vs. Nadelinjektion nach 2 Monaten). e, Immunhistochemische Färbung des COL1A1-Proteins und Masson-Trichrom-Färbung nach 1 Monat (28 Tage), 2 Monaten (63 Tage) und 3 Monaten (91 Tage). Maßstabsbalken, 200 µm. f, Quantifizierung der Hautdicke durch Masson-Trichrom-Färbung (n = 3 für alle Gruppen; **P = 0,0062 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat; *P = 0,034 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung nach 2 Monaten). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die Vergleiche in d und f wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet.

Extrazelluläre Vesikel haben sich aufgrund ihrer inhärenten Eigenschaften wie Biokompatibilität, geringer Immunogenität und der Fähigkeit, aus gesunden menschlichen Zellen gewonnen zu werden, als Medikamentenverabreichungssystem der nächsten Generation herausgestellt12. Dennoch haben die meisten Studien, die sich bisher auf die Abgabe von Nukleinsäuren konzentrierten, kleine Moleküle im Bereich von 10–20 nt wie microRNAs und small interfering RNA (siRNAs) als Nutzlast eingekapselt, wohingegen größere Nukleinsäuren wie mRNAs aufgrund der Größe selten evaluiert werden Schwierigkeit, sie in Elektrofahrzeuge zu laden42. Mit den jüngsten Fortschritten beim Nutzen mRNA-basierter Therapeutika zur Behandlung menschlicher Krankheiten ist das Interesse an der Verwendung von Elektrofahrzeugen als mRNA-Abgabesystem gestiegen. Kürzlich haben wir eine mRNA-Beladungstechnik entwickelt, die die groß angelegte Produktion von Elektrofahrzeugen mit intakter endogener mRNA für die Nukleinsäuretherapie ermöglicht14. Hier haben wir gezeigt, dass mRNA-beladene EVs für die Proteinersatztherapie in einem Modell der dermalen Kollagen-Photodepletion eingesetzt werden können17. Wir haben gezeigt, dass CNP in der Lage ist, hohe Kopienzahlen von COL1A1-mRNA (~4.000+ nt) in EVs zu laden, was mit Post-Insertion-Lademethoden nicht erreicht werden kann43,44. In-vivo-Ergebnisse zeigten, dass diese COL1A1-EVs die COL1A1-Proteinexpression in der Maushaut nach der Lichtalterung wiederherstellen können. Wir untersuchten auch das Vorhandensein von COL1A1-mRNA und -Protein im Laufe der Zeit in vivo und stellten fest, dass das entsprechende Protein bereits 12 Stunden nach der Abgabe mit einem Peak nach 4 Tagen translatiert wurde und dass dies je nach Dosis mehrere Wochen anhielt. Mehrere Studien haben ex vivo das COL1A1-Protein als Kollagenfüllstoff erzeugt; Hier haben wir die In-vivo-Kinetik der exogenen COL1A1-mRNA-Abgabe und der Proteinexpression in vivo charakterisiert.

Um unseren Ansatz für den langfristigen Proteinersatz anzupassen, haben wir ein Mikronadel-Array für die Abgabe von COL1A1-EVs weiterentwickelt, um eine gleichmäßige Verteilung der EVs im lokalen Gewebe mit reduziertem Membranbruch zu ermöglichen. HA ist ein entscheidendes Element der extrazellulären Matrix und weist nachweislich eine ausgezeichnete Biokompatibilität mit Hautgewebe und verschiedenen Biomaterialsystemen auf46,47. Durch die Integration von EVs in ein HA-Mikronadel-Biomaterial konnten wir die Proteintransplantation von COL1A1 in den ausgewerteten Hautproben auf mehr als 60 Tage verlängern. Bemerkenswerterweise konnten auch Elektrofahrzeuge, die nicht mit COL1A1-mRNA beladen waren, eine geringfügige Verringerung der Faltenzahl erreichen, was mit Studien übereinstimmt, die ergaben, dass „leere“ Elektrofahrzeuge aus bestimmten Elternzellen aufgrund endogener Ladungen potenzielle therapeutische Kandidaten sind (immer noch die detaillierten zugrunde liegenden Mechanismen). solche Phänomene bedürfen weiterer Erforschung)36.

Verglichen mit der relativ lang anhaltenden Expression DNA-basierter Gentherapien können mRNA-Therapeutika dazu beitragen, die Gentherapie voranzutreiben und das Risiko unerwünschter Ereignisse zu verringern, da die mRNAs im Zytoplasma verbleiben, ohne in den Zellkern einzudringen48,49. Daher haben mRNA-basierte Modalitäten Vorteile gegenüber DNA-basierten und virusbasierten Gentherapien, wie z. B. die Fähigkeit, den traditionellen Transkriptionsprozess zu umgehen, und kein Risiko einer genomischen Integration (im Gegensatz zur Verwendung einiger Adeno-assoziierter Virusvektoren). von denen traditionell angenommen wird, dass sie ein geringes Risikoprofil aufweisen50). Allerdings ist die klinische Umsetzung von mRNA-Therapeutika noch begrenzt. Bei mRNA-Produkten, die unter Verwendung von LNPs entwickelt wurden, wurde die Immunogenität von PEGylierungskomponenten auf der LNP-Oberfläche sowie einigen Trägerformulierungen mit Entzündungen und zahlreichen unerwünschten Sicherheitsereignissen in Verbindung gebracht51,52. Als wir die Abgabe von COL1A1-LNPs und COL1A1-EVs in vivo verglichen, stellten wir tatsächlich fest, dass COL1A1-LNPs in der Lage waren, Kollagenprotein zu produzieren und Hautfalten zu reduzieren, im Gegensatz zu COL1A1-EVs jedoch auch ein deutliches entzündliches Infiltrat im lokalen Gewebe verursachten nicht. Mehrere aktuelle Studien haben gezeigt, dass Elektrofahrzeuge durch eine geringe Immunogenität gekennzeichnet sind. Einige präklinische Berichte und klinische Studien (clinicaltrials.gov: NCT05191381, NCT05216562) deuten darauf hin, dass aus einer Vielzahl von Zelltypen gewonnene Elektrofahrzeuge immunsuppressive Wirkungen haben, obwohl dies beachtet werden sollte dass diese Studien hauptsächlich mesenchymale Stromazellen und dendritische Zellen als Spenderzelltypen verwendeten36,53,54.

Zu den zukünftigen Herausforderungen für die klinische Anwendung von COL1A1-EV MN gehören die Optimierung der Mikronadelgeometrie mit dichter geschützten EVs sowie optimierte Lagerbedingungen, da mRNA einem schnellen Abbau unterliegt, wenn sie nicht bei –80 °C oder darunter aufbewahrt wird55. Im Idealfall können zukünftige EV-Systeme als gebrauchsfertige Aliquots verpackt und bei geeigneten Temperaturen versendet werden, was die Praktikabilität von COL1A1-EV-MN-Systemen für den klinischen Einsatz erheblich verbessern würde. Unser Ziel ist es auch, die therapeutischen Anwendungen in unserem System auf Elemente wie COL7 für genetisch seltene Krankheiten wie Epidermolysis bullosa56 auszuweiten. Wir haben mRNA nur über das Mikronadelsystem geliefert, doch das System eignet sich auch zum Verpacken anderer Arten von EV-Ladungen, wie miRNAs und siRNAs, und anderer bioaktiver therapeutischer Wirkstoffe wie Peptide und Proteine57,58,59. Obwohl viele Herausforderungen überwunden werden müssten, bevor das auf Mikronadeln basierende EV-Abgabesystem beim Menschen ausprobiert werden kann, sind wir aufgrund der verbesserten Biokompatibilität und des harmlosen Nebenwirkungsprofils von EVs im Vergleich zu LNPs und dem Adeno-assoziierten Virus (AAV) glauben, dass das System einen universellen Nukleinsäureträger für die Behandlung einer Reihe menschlicher Krankheiten und Leiden darstellen könnte.

nHDFs (PCS-201-010) wurden von ATCC gekauft und in DMEM-Medium (Thermo Fisher), das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS; 10099141C, Thermo Fisher) enthielt, bei 37 °C unter feuchten Bedingungen, äquilibriert mit 5 % CO2, kultiviert .

Für CNP wurde eine einzelne Schicht nHDF auf eine 1 cm × 1 cm große 3D-CNP-Oberfläche zur Inkubation über Nacht wie zuvor beschrieben ausgesät. Humanes COL1A1-cDNA-Plasmid (NM_000088.3) mit GFP-Tag wurde von Sino Biological (HG11776-ACG) erworben. In PBS-Puffer vorgeladene Plasmide wurden über Nanokanäle unter Verwendung einer elektrischen Feldstärke von 250 V cm−1 mit 10 Impulsen zu 10 ms pro Impuls und einem Intervall von 0,1 s in einzelne Zellen injiziert. Um optimale Bedingungen zu ermitteln, wurden verschiedene Elektroporationsbedingungen getestet. BEP (Gene Pulser xcell, Bio-rad) wurde mit einer elektrischen Feldstärke von 1.250 V cm−1 und einem Impuls von 20 ms durchgeführt. pCMV-COL1A1-GFP-Plasmide wurden in einer Konzentration von 500 ng ml−1 in PBS zur Transfektion hergestellt.

Die Zellen wurden in DMEM-Medium, das Serum enthielt, kultiviert. Das serumhaltige Zellkulturmedium wurde bei der Durchführung von CNP entfernt. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und nach der CNP 24 Stunden lang in serumfreiem Zellkulturmedium kultiviert. EVs wurden aus Zellkulturüberständen gesammelt. Kurz gesagt, das Zellkulturmedium (CCM) wurde 5 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, und anschließend erneut 30 Minuten lang bei 2.000 × g zentrifugiert. Zur Konzentration des CCM wurde eine Amicon Ultra-4-Zentrifugalfiltereinheit (10 kDa, Millipore, 801024) verwendet. Die EV-Probe wurde unter Verwendung eines Total-Exosomen-Isolierungsreagenzes (Invitrogen, 4478360) gereinigt. Größe und Anzahl der EV-Partikel wurden mit NanoSight NS300 (Malvern) gemessen. Die RNA-Ausbeute und Größenverteilung wurden mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer mit einem RNA 6000 Pico-Kit (Agilent Technologies) analysiert.

Die Expression menschlicher COL1A1-mRNA in Elektrofahrzeugen wurde mithilfe von RT-qPCR gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll gemessen. Kurz gesagt, Gesamt-RNA aus gereinigten Elektrofahrzeugen wurde mit einem RNA-Reinigungs-Minikit (Norgen Biotek, 55000) und einem DNA-Entfernungskit (Norgen Biotek, 25720) erhalten. Zur Synthese der komplementären Erststrang-DNA wurde ein SuperScript III-Erststrangsynthesesystem (Invitrogen) mit zufälligen Hexameren als Primern verwendet. Die Expression von Genen wurde mit TB Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820) gemessen. Die verwendeten Primersequenzen waren wie folgt: COL1A1 (menschlich), vorwärts: 5'-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3' und rückwärts: 5'-ACCATCCAAACCACTGAAAC-3'; Gapdh (Mensch), vorwärts: 5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA – 3′ und rückwärts: 5′ – AGAGGCAGGGATGATGTTCT – 3′ (Ergänzungstabelle 1).

Nackte weibliche Mäuse (10–12 Wochen alt) wurden mit Isofluran anästhesiert und in den dorsalen Hautbereich wurden 50 μl 2,7 × 109 Kopienzahl von CNP COL1A1-mRNA-EVs injiziert. Zu vordefinierten Zeitpunkten (12, 24, 48, 96 Stunden, 7 Tage, 10 Tage, 14 Tage) nach der Hautinjektion wurde die Haut herausgeschnitten und zur Fixierung in 4 % Formaldehyd gelegt. Anschließend wurden die Scheiben in Paraffin eingebettet und weiter in 4 μm-Scheiben geschnitten. Der automatisierte In-situ-Hybridisierungstest von RNAscope zum Nachweis menschlicher COL1A1-mRNA wurde mit dem HybEZ II-Hybridisierungssystem (Advanced Cell Diagnostics (ACD)) durchgeführt, und alle In-situ-Hybridisierungsreagenzien waren ACD-Produkte. Kurz gesagt, die Zielgewinnung wurde 15 Minuten lang bei 95 °C mit Leica Epitope Retrieval Buffer 2 durchgeführt, gefolgt von einer 15-minütigen Proteasebehandlung bei 42 °C. Die Sonde (RNAscope Probe-Hs-COL1A1, 401891, ACD) wurde 2 Stunden lang bei 40 °C hybridisiert, gefolgt von einer RNA-Scope-Amplifikation, und das RNAscope 2.5 HD Assay BROWN-Kit wurde zur Visualisierung der Färbung verwendet. Als Negativkontrolle wurde RNAscope 2.5 LS probe-Rn-Ppib verwendet.

Gewebeschnitte wurden mit 4 % Paraformaldehyd 20 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS (Vetec) gewaschen. Anschließend wurde das Gewebe 15 Minuten lang auf 0,2 % Triton Schließlich wurde der sekundäre Antikörper (ab6939 und ab6717, Abcam) hinzugefügt und die Gewebeschnitte 60 Minuten lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Anschließend wurden die Gewebeschnitte mit PBS gewaschen, zur Kernfärbung mit DAPI (ThermoFisher) versetzt und dann zur Beobachtung montiert.

Gewebeschnitte wurden 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS (pH 7,4) gewaschen und dann zur Antigen-Gewinnung in einer Entnahmebox mit Antigen-Gewinnungslösung aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 9,0) überführt Mikrowelle. Anschließend wurden die Schnitte 25 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur in 3%iger Wasserstoffperoxidlösung inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde das Gewebe gleichmäßig mit 3 % BSA oder 10 % normalem Kaninchenserum bedeckt, 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert, mit primärem Antikörper (ab34710 und ab6556, Abcam) versetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Dann wurde ein sekundärer Antikörper (HRP-markiert), der dem primären Antikörper entsprach, hinzugefügt, um die Gewebeschnitte abzudecken, die dann 50 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Für die Farbentwicklung mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) wurden die Objektträger in PBS (pH 7,4) gegeben und dreimal unter jeweils 5-minütigem Schütteln auf einem Entfärbungsschüttler gewaschen. Nachdem die Scheiben leicht getrocknet waren, wurde die frisch zubereitete DAB-Farbentwicklungslösung tropfenweise in den Kreis gegeben. Die Entwicklungszeit wurde unter dem Mikroskop kontrolliert. Hämatoxylin, Hämatoxylin-Differenzierungslösung und Hämatoxylin-Blau-Rückführungslösung wurden nacheinander zur Kerngegenfärbung hinzugefügt. Schließlich wurden die Glasobjektträger zur Dehydrierung und Versiegelung in wasserfreies Ethanol und Xylol gegeben.

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Shenzhen Bay Laboratory (Nr. D2021-107) oder Partnerlabors genehmigt. Um das Hautalterungsmodell zu erstellen, wurden weibliche Nacktmäuse (10–12 Wochen alt) 8 Wochen lang jeden zweiten Tag wie folgt einer UVB-Bestrahlung der Rückenhaut ausgesetzt: Mäuse wurden mit 1,5 % Isofluran betäubt und dann wurde UV-Bestrahlung abgegeben mit einer UV-Lampe (Philips; Emissionsspektrum 311 nm), die 8 Wochen lang jeden zweiten Tag 30 cm über der Rückenhaut der Mäuse positioniert wurde. Die UV-Bestrahlungsintensität, dargestellt als minimale Erythemdosis (MED), wurde in den ersten 2 Wochen auf 1 MED (60 mJ cm-2) eingestellt und in der dritten Woche auf 2 MED (120 mJ cm-2) erhöht, 3 MED (180 mJ cm-2) in der vierten Woche und 4 MED (240 mJ cm-2) in der fünften bis achten Woche des Experiments. Das gesamte bestrahlte UVB-Volumen betrug etwa 80 MED. Für die spritzenbasierte Behandlung von lichtgealterter Haut wurden Nacktmäuse nach der oben beschriebenen 8-wöchigen Bestrahlungsperiode einer von 6 Behandlungsgruppen (jeweils 4 Mäuse) zugeordnet: (1) UVB-Bestrahlung + Kochsalzlösung, (2) UVB-Bestrahlung + 0,05 % Retinsäure, (3) UVB-Bestrahlung + unbeladene nHDF-EVs, geliefert mit einer 32G-Hamilton-Spritze, (4) UVB-Bestrahlung + 2,7 × 109 Kopienzahl COL1A1 mRNA COL1A1-LNPs, (5) UVB-Bestrahlung + 2,7 × 109 Kopienzahl COL1A1-mRNA-COL1A1-EVs, abgegeben mit einer 32G-Hamilton-Spritze und (6) ohne UVB-Exposition (Schein). Die Hautbehandlungen fanden an den Tagen 0, 4, 7, 14 und 21 statt. Die gesamte Rückenhaut wurde zur Analyse in drei Teile geteilt.

Ein SILFLO-Silikonnachbau und ein Ringsuchgerät wurden von Clinical & Derm erworben. Am Ende des Behandlungszeitraums wurden Repliken der Rückenhaut (Rückenhaut) der Mäuse erhalten. Die Replikate wurden mittels Stereomikroskopie (Olympus SZX7) analysiert und die entsprechenden Bilder wurden von ImageJ (NIH) analysiert.

Die Herstellung des Mikronadelpflasters erfolgte unter Verwendung einer Silikon-Mikroform, wobei jeder Nadelhohlraum einen runden Basisdurchmesser von 400 μm und eine Höhe von 1.000 μm hatte. Diese Nadelhohlräume wurden in einem 10 × 10-Array mit einem Abstand von Spitze zu Spitze von 700 μm angeordnet. Zur Herstellung des Mikronadelpflasters wurden 150 μl einer 15 Gew.-%igen HA-Lösung mit 50 μl EVs gemischt, 30 Minuten lang unter Vakuum gehalten und dann auf 4 °C überführt, bis es in der Nadelhöhle abgelagert wurde. Schließlich wurde 1 ml einer 15 Gew.-%igen HA-Lösung auf die Mikroform geladen und die Mikroform in eine Trockenkiste mit angeschlossenem Ventilator gestellt, um den Verdampfungsprozess zur Verfestigung zu beschleunigen. Nach dem Erstarren wurde das Mikronadelpflaster zur weiteren Verwendung aus der Silikonform gelöst. Um die Abgabe von COL1A1-EV über die maßgeschneiderten Mikronadelpflaster zu beurteilen, wurden Nacktmäuse 8 Wochen lang wie oben beschrieben bestrahlt und einer von 5 Behandlungsgruppen (jeweils 4 Mäuse) zugeordnet: (1) UVB-Bestrahlung + Kochsalzlösung, (2) UVB-Bestrahlung + 22 × 109 Kopienzahl COL1A1-mRNA-COL1A1-EVs, abgegeben mit einer 28G-Hamilton-Spritze, (3) UVB-Bestrahlung + HA-Mikronadelpflaster, (4) UVB-Bestrahlung + 1010 unbeladene nHDF-EVs, abgegeben über Mikronadel (entladene EV-Mikronadel) und (5) UVB Bestrahlung + 15 % HA-Mikronadel, gemischt mit 22 × 109 Kopienzahl COL1A1-mRNA COL1A1-EVs.

Mit Mikronadeln behandelte Mäuse wurden an den Tagen 1, 2, 4, 7, 10 und 14 mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS Spectrum, Perkin Elmer) abgebildet. Die Parameter wurden wie folgt eingestellt: Belichtungszeit 15 s, Anregung 570 nm, Emission 680 nm, 2F/Blende und 13,6 cm Sichtfeld bei den angegebenen Fluoreszenzbildgebungszeiten. Die quantitative Analyse der RFP-Fluoreszenzintensität wurde durch Messung der durchschnittlichen Strahlungseffizienz (Photon s−1 cm−2 sr−1 µW−1) in einem interessierenden Bereich durchgeführt. Die Daten wurden auf die Fluoreszenzintensität am ersten Tag normalisiert.

Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. In dieser Studie wurden keine Daten ausgeschlossen. Um den statistischen Unterschied zwischen zwei Gruppen zu analysieren, wurden für die Vergleiche zweiseitige Student-t-Tests verwendet. Für zwei oder mehr Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet, um den statistischen Unterschied zu analysieren. Für die Analyse der statistischen Differenz zwischen Datenpunkten in Gruppen wurde die Zwei-Wege-ANOVA gewählt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Für die Datenanalyse wurde GraphPad Prism 8.3 verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Quelldaten für die Zahlen sind bei figshare unter https://figshare.com/articles/dataset/SD_FIGS_xlsx/21514641 verfügbar. Die im Rahmen der Studie generierten Rohdaten und analysierten Datensätze stehen auf begründete Anfrage für Forschungszwecke bei den entsprechenden Autoren zur Verfügung.

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Wir danken C. Wogan von der Abteilung für Radioonkologie des MD Anderson Cancer Center für die redaktionelle Unterstützung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yi You, Yu Tian und Zhaogang Yang.

Graduiertenschule der Peking-Universität Shenzhen, Shenzhen, China

Yi You, Yu Tian, ​​​​Yuhao Tong, Andreanne Poppy Estania, Jianhong Cao, Wei-Hsiang Hsu, Yutong Liu und Andrew S. Lee

Institut für Krebsforschung, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, China

Yi You, Yu Tian, ​​​​Yuhao Tong, Andreanne Poppy Estania, Jianhong Cao, Wei-Hsiang Hsu, Yutong Liu und Andrew S. Lee

Abteilung für Radioonkologie, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, USA

Zhaogang Yang, Benjamin R. Schrank, JongHoon Ha, Shiyan Dong, Xuefeng Li, Yifan Wang und Wen Jiang

Fakultät für Biowissenschaften, Jilin-Universität, Changchun, China

Zhaogang Yang, Ziwei Li, Yarong Zhao, Huan Zhang und Lesheng Teng

Spot Biosystems Ltd., Palo Alto, Kalifornien, USA

Junfeng Shi, Kwang Joo Kwak und Ly James Lee

Abteilung für Chemie- und Biomolekulartechnik, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Chi-Ling Chiang

Abteilung für Neurochirurgie, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, USA

Kristin Huntoon, DaeYong Lee, Thomas D. Gallup und Betty YS Kim

Das Sechste angegliederte Krankenhaus der Medizinischen Universität Guangzhou, Qingyuan Volkskrankenhaus; Staatliches Schlüssellabor für Atemwegserkrankungen, Chinesisch-Französisches Hoffmann-Institut, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou, China

Xuefeng Li

Fuwai-Krankenhaus der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften Shenzhen, Shenzhen Key Laboratory für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, State Key Laboratory für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Peking Union Medical College, Shenzhen, China

Wen-Jing Lu & Feng Lan

Pekinger Labor für kardiovaskuläre Präzisionsmedizin, Schlüssellabor für biomedizinische Technik für die Forschung zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Schlüssellabor für remodellierungsbedingte Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Bildungsministerium, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Peking, China

Wen-Jing Lu

Abteilung für Dermatologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, USA

Eman Bahrani

Brain Tumor Center, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, USA

Kristin Huntoon, DaeYong Lee, Thomas D. Gallup und Betty YS Kim

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ASL und FL konzipierten die Arbeit; ASL, WJ, FL, ZY und BYSK überwachten die Forschung; ASL, JS, LJL und KJK haben die Technologie entwickelt; ASL, YY, YT, FL, WJ, ZY, LT und BYSK haben die Experimente entworfen; ASL, LJL, ZY, YT, YY, WJ, FL, BYSK, KJK, JS, BS, KH, DL, TG, LT, W.-JL und EB lieferten intellektuellen Input; ASL, LJL, ZY, WJ, JS, SD, EB und BYSK haben das Manuskript geschrieben, mit Beiträgen aller Autoren; YY, YT, JS, KJK, YT, APE, JC, C.-LC, W.-HHYL, ZL, YZ, HZ, XL, YW und JH führten Experimente durch; YY, YT, ZY und APE haben Zahlen und Videos erstellt.

Korrespondenz mit Feng Lan, Betty YS Kim oder Andrew S. Lee.

ASL und LJL sind Berater und Anteilseigner von Spot Biosystems, Ltd. JS und KJK sind Mitarbeiter von Spot Biosystems, Ltd.

Nature Biomedical Engineering dankt Sun Hwa Kim, Chuanbin Wu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Fluoreszenzbilder von serumarmen nHDFs, behandelt mit COL1A1-GFP-EVs und Protein, das aus zugeführter COL1A1-GFP-mRNA translatiert wurde, nach 48 Stunden. Maßstabsbalken, 100 µm. b, Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit COL1A1-EVs behandelt wurden (n = 3 für alle Gruppen, ***P < 0,001 Kontrolle vs. COL1A1-EVs) in 48 Stunden. c, RT-qPCR zeigt höhere Kollagen-mRNA-Transkriptwerte nach In-vitro-Abgabe von COL1A1-mRNA aus EVs (n = 3 für alle Gruppen, ***P < 0,001 Kontrolle vs. COL1A1-EVs) in 48 Stunden. d, Western Blots zeigen erhöhtes COL1A1-Protein in behandelten Fibroblasten (n = 3 für alle Gruppen, **P = 0,001 Kontrolle vs. COL1A1-EVs).e, Pro-Kollagen I, gesammelt aus dem Überstand und nachgewiesen durch ELISA (n = 3 für alle). Gruppen, ***P < 0,001 Kontrolle vs. COL1A1-EVs) in 48 Stunden. Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt; Für die Vergleiche in (b–e) wurden zweiseitige Student-t-Tests verwendet.

a, Mikroskopische Beobachtungen von Rückenhaut und Hautnachbildungen. Maßstabsleiste, 5 mm. b, Mittlere Faltentiefe in Hautrepliken (n = 4 für alle Gruppen, ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung; **P = 0,0025 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung; +++P < 0,001 COL1A1-EVs vs. COL1A1 -LNPs). c, Mittlere Faltenlänge, analysiert an Hautreplikaten (n = 4 für alle Gruppen, #P = 0,0203 unbelastete EVs vs. Kochsalzlösung; *P = 0,0405 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung; ++ P = 0,0015 COL1A1-EVs vs. COL1A1-LNPs. Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für die Vergleiche in (b, c) wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. NS, nicht signifikant.

a: Hautproben von Mäusen, denen eine Einzeldosis von COL1A1-mRNA mit der Kopienzahl 22E9 in COL1A1-EVs und COL1A1-LNPs injiziert worden war, wurden nach 24 Stunden geerntet. Hautproben von Mäusen wurden mittels Durchflusszytometrie auf b, Leukozytenzellprozentsatz, und c, Neutrophilenprozentsatz, analysiert (n = 3 für alle Gruppen, **P = 0,0034 COL1A1-LNPs vs. Schein für %CD45+-Zellen; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs. Sham für % Neutrophile unter CD45+-Zellen; NS, nicht signifikant). d, Proteinquantifizierung mittels ELISA für IFN-γ, IL-1β, IL-6 und TNF-α zeigt einen Anstieg inflammatorischer Zytokine in der COL1A1-LNPs-Gruppe im Vergleich zu COL1A1-EVs (n = 3 für alle Gruppen, **P = 0,0074 COL1A1-LNPs vs. Schein für IFN-γ; #P = 0,0333 COL1A1-EVs vs. Schein und ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs. Schein für IL-1β; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs. Schein für IL-6; *P = 0,0146 COL1A1-LNPs vs. Schein für TNF-α; NS, nicht signifikant). e, Repräsentative Immunfärbungsbilder für TNF-α und (f) IL-6 nach Injektion von COL1A1-EVs und COL1A1-LNPs. Maßstabsbalken, 100 µm. Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für die Vergleiche in (b–d) wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet.

a: Falten wurden an den Tagen 0, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 und 56 Tage nach den angegebenen Behandlungen verfolgt (5 niedrig dosierte Injektionen von COL1A1-EVs (2,7E9 Kopienzahl COL1A1-mRNA)) , COL1A1-LNPs (2.7E9 Kopienzahl COL1A1 mRNA), unbeladene EVs, 0,05 % Retinsäure [RA], Kochsalzlösung). n = 4, Maßstabsbalken, 5 mm. Die Scheingruppe umfasste weibliche Nacktmäuse, die keiner UV-Strahlung ausgesetzt waren. b, Anzahl der Falten auf der Rückenhaut der Mäuse im Laufe der Zeit. (n = 4 für alle Gruppen; **P = 0,008 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 7; **P = 0,004 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 21, **P = 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 35; ***P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung an den Tagen 14, 28, 42 und 49; †P = 0,025 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ††P = 0,007 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 28; ##P = 0,0071 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 14; ##P = 0,004 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ##P = 0,002 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 28; #P = 0,015 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 35; ※※P = 0,0053 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 14; ※※P = 0,0041 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ※P = 0,017 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 28; ※P = 0,022 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 35) . c, Gesamtfaltenfläche (n = 4 für alle Gruppen, *P = 0,012 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 7; ***P < 0,001 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung an den Tagen 14, 21, 28 und 35; *P = 0,015 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung am Tag 42; ††P = 0,008 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 14; ††P = 0,007 RA vs. Kochsalzlösung an den Tagen 21 und 35;††P = 0,005 RA vs. Kochsalzlösung am Tag 28; #P = 0,012 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 14; #P = 0,035 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ##P = 0,002 Unbeladene Elektrofahrzeuge vs. Kochsalzlösung am Tag 28; ※P = 0,062 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 14; ※P = 0,039 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 21; ※※P = 0,0027 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 28; ※※P = 0,046 COL1A1-LNPs vs. Kochsalzlösung am Tag 35). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für die Vergleiche in (b, c) wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet.

a–c, Mikroskopische Beobachtung der Rückenhaut und der Hautnachbildung 1 Monat, 2 Monate und 3 Monate nach der Behandlung. Maßstabsleiste, 5 mm. d, e Quantifizierung der mittleren Faltenlänge (n = 4 für alle Gruppen, ***P < 0,001 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat und 2 Monaten; ###P < 0,001 Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat; † †P = 0,031 HA MN vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat;※※P = 0,029 Unbeladenes EV MN vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat) und mittlere Faltentiefe (n = 4 für alle Gruppen, ***P < 0,001 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat; **P = 0,001 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung nach 2 Monaten; Nadelinjektion vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat nicht signifikant; HA MN vs. Kochsalzlösung nach 1 Monat nicht signifikant) aus Hautreplikaten. Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für die Vergleiche in (d, e) wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet.

a: Nach 8 Wochen UV-bestrahlter Photoalterung wurden Falten bei Mäusen verfolgt, die alle 30 Tage mit 1) Kochsalzlösung, 2) COL1A1-EVs und 3) COL1A1-EV MN an den Tagen 0, 4, 7, 14, 21, 28 behandelt wurden , 49, 70 und 91 (COL1A1-EVs, COL1A1-EV MN, Kochsalzlösung). n = 4, Maßstabsbalken, 5 mm. b, Gesamtzahl der Falten (n = 4 für alle Gruppen; *P = 0,019 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 4; #P = 0,034 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,031 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 7 ; #P = 0,030 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, **P = 0,008 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 14; **P = 0,008 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 21; *P = 0,025 COL1A1-EV MN vs Kochsalzlösung am Tag 28; **P = 0,006 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 35; #P = 0,031 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,030 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 42; #P = 0,044 COL1A1- EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,016 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 49; *P = 0,016 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 56; #P = 0,017 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,020 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 63; *P = 0,018 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 70; #P = 0,011 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, **P = 0,006 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 77; #P = 0,028 COL1A1 -EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,037 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 84; #P = 0,043 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,043 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 91) und c, Faltenbereich auf der Rückenhaut der Mäuse während des 90-Tage-Studienfensters (n = 4 für alle Gruppen; #P = 0,012 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, **P = 0,005 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 7; #P = 0,010 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,048 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 14; #P = 0,023 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,021 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 21; *P = 0,022 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 28; *P = 0,046 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 35; #P = 0,019 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, **P = 0,009 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 42; #P = 0,042 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,030 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 49; *P = 0,030 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 63; *P = 0,029 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 70; #P = 0,048 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,022 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 77; #P = 0,040 COL1A1-EVs vs. Kochsalzlösung, *P = 0,027 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 84; *P = 0,045 COL1A1-EV MN vs. Kochsalzlösung am Tag 91). Alle Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für die Vergleiche in (b, c) wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet.

Ergänzende Methoden, Ergebnisse und Diskussion, Materialien, Abbildungen, Tabellen und Referenzen.

Mikronadeln, die HA-EVs auf der Haut von Mäusen abgeben.

Ex-vivo-Zeitverlauf der Auflösung der Spitzen von Mikronadeln, die HA-EVs in die Haut abgeben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

You, Y., Tian, ​​Y., Yang, Z. et al. Intradermal verabreichte mRNA-verkapselnde extrazelluläre Vesikel für die Kollagenersatztherapie. Nat. Biomed. Eng 7, 887–900 (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

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Eingegangen: 01. April 2022

Angenommen: 18. November 2022

Veröffentlicht: 12. Januar 2023

Ausgabedatum: Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

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Arzneimittelabgabe und translationale Forschung (2023)